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芝麻致敏原的实时荧光PCR检测_杂志文章
芝麻致敏原的实时荧光PCR检测
发布时间:2018-04-21浏览次数:263返回列表

[摘 要] 针对芝麻Sesamum indicum 2S albumin mRNA基因设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和分析.结果显示:该组探针和引物对芝麻有很强的特异性,除黑芝麻和白芝麻外,其余6种对照材料均未检测到荧光信号,黑白芝麻成分检测灵敏度达到0. 10-10.该方法具有灵敏度高、快速、简便的特点,可用于芝麻致敏原成分的定量检测.

食物过敏医学上也称变态反应,是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后,产生相应的抗体或致敏淋巴细胞,当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应,由此导致组织损伤或机体生理机能障碍.它是一种复发率很高的疾病.引起变态反应的抗原被称为变应原,又名致敏原,根据流行病学调查,近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势[2-3].发达国家每年有超过20%的人受过敏性疾病的困扰,我国的发病率高于发达国家[4-5].目前食物过敏尚属不治之症,患食物过敏症的消费者必须避免食用含致敏原成分的食品.目前大约有160多种食品致敏原,芝麻为常见的致敏原之一,因此对芝麻成分的检测尤为重要.

芝麻又名胡麻,原产于我国云贵高原,是胡麻科(Pedaliaceae)胡麻属(Sesamun]植物,芝麻分为白芝麻和黑芝麻两种[6].

本文采用实时荧光PCR技术检测芝麻成分.Taq Man探针实时荧光PCR是在常规PCR反应体系中添加了一条标记了2个荧光基团的探针,在探针的5’端标记荧光报告基团,在探针的3’端标记荧光淬灭基团,两者可构成能量传递结构.在通常情况下荧光报告基团所发出的荧光可被荧光淬灭基团吸收,当二者距离变远时,抑制作用减弱,报告基团荧光信号增强.当在PCR扩增过程中,Taq Man探针同PCR产物杂交,由于TaqDNA聚合酶具有5’端外切酶活性,在引物延伸阶段将杂交在模板上的荧光探针5’端荧光报告基团切下,而脱落在溶液中,加大了与淬灭基团的距离,从而引起报告基团发出荧光信号.随着PCR的进行,愈来愈多的报告基团被切下,荧光信号也随着增强,它是模板被PCR扩增,Taq Man探针与PCR产物杂交的直接标志.即只有在引物和探针都与模板杂交,才能检测到荧光信号.如果探针不能与模板特异性的结合,即使在引物的作用下模板在PCR过程中得以扩增,但检测不到荧光信号.实时荧光PCR仪就是根据上述原理,在PCR过程中连续地检测反应体系中荧光信号的变化.当信号增强到某一阈值时,此时的循环次数(CT)就被记录下来.该CT值与PCR体系中起始模板量的对数值有严格的线性关系.因此可定性确定反应体系中是否有模板DNA,而且可相对确定反应体系中DNA的量.

通过文献查阅及BlAST比对,本文拟利用Sesamum indicum 2S albumin mRNA基因序列作为芝麻成分鉴别的靶序列设计引物及探针.建立了芝麻成分的快速检测体系。1材料及方法1.1材料

试验所用材料黑芝麻、白芝麻、诸葛菜、芥菜、萝卜、大豆、油菜、大米和玉米均购于大连家乐福超市(选取常见的与芝麻相近科属的植物作为比较实验材料).1.2引物及探针

NCBI检索Sesamum indicum 2S albumin mRNA基因序列(AF240005),设计多条引物探针,由大连宝生物公司合成,经过实验比较,确定性能最优的组合,引物与探针序列为2结果使用本引物和探针对芝麻等8种样本进行实时荧光PCR扩增,结果如图l,其他样本检测均无典型PCR扩增曲线,而对黑芝麻和白芝麻的检测则产生典型的PCR扩增曲线,结果表明,试验设计的引物和探针具有较高的物种特异性.从图2和3中可以得出,黑、白芝麻实时荧光PCR最底检测限为0.10-10.3讨论

芝麻是比较常见的致敏原之一,因此对食品中芝麻成分的检测对于防止食物过敏十分重要,本文利用实时荧光PCR方法对其进行检测在国内尚属首次,尤其对深加工产品中芝麻成分的检测实时荧光PCR方法相比蛋白检测方法具有检测灵敏度高的优势,目前对深加工食品的蛋白检测限一般可达1%,而本文研究的实时荧光PCR方法的检测限可达0.1%.

选择芝麻同科的十字花科材料以及豆科与和本科材料进行特异性试验.Sesamum indicum 2S albuminmRNA基因序列(AF240005)经BLAST比对与上述6种样本的同源性较低,因此可以作为靶基因进行芝麻成分的检测.

本文采用实时荧光PCR检测方法,不需要进行PCR的后续处理,大大简化了实验步骤,缩短了检测时间,降低了污染风险,提高了检测准确度.目前可认为该检测体系适于对食品中的芝麻致敏原成分进行快速检测.

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