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《中国烟草科学》杂志
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安徽省烟草病毒种类的血清学鉴定_杂志文章
安徽省烟草病毒种类的血清学鉴定
发布时间:2018-05-09浏览次数:22返回列表

摘 要:2007年从安徽亳州、宣城和芜湖等地的烟草产区共采集181个表现明显病毒病症状的病样,采用Tas-ELISA和间接ELISA方法共检测112个病样,其中分别检测宣城黄渡、宣城金坝、芜湖红杨、芜湖三元各16个病样以及亳州陈店48个病样。结果显示,安徽宣城32个病样中,TMV,CMV,PVY的阳性率分别为91%,3%,50%,芜湖32个病样中,TMV,CMV,PVY的阳性率分别为66%,0.75%,说明宣城、芜湖烟区侵染烟草的病毒种类以TMV,PVY为主,CMV为零星侵染;亳州48个病样中,TMV,CMV,PVY的阳性率分别为100%,48%,8%,说明亳州烟区侵染烟草的病毒种类以TMV,CMV为主,PVY侵染发生较少。

追溯烟草病毒病在安徽省皖北烟区的发展历史,CMV和TMV在20世纪80年代已普遍发生。1991年全国烟草病害普查课题研究总结中明确指出,PVY在安徽省将有上升趋势,且在传统烟区发生较多。20世纪90年代末,PVY在皖北的发生比例逐年提高,且PVY和CMV复合侵染现象不断增多。在随后几年的调查中发现,PVY与CMV的复合侵染越来越明显。自1999年皖北部分乡镇PVY引起的病毒病大暴发以来,病毒病已成为影响皖北烤烟生产的主要因素之一。2000年整个皖北烟区病毒病损失严重,致部分烟田绝收。

近几年,由于安徽省烟草种植结构的调整,安徽省烟草种植中心逐渐从以毫州、固镇为中心的皖北烟区向以宣城为中心的皖南烟区转移,安徽省烟草病毒病种类也发生了很大变化。田间调查发现,皖北烟草病毒病危害有增无减,己成为制约皖北烟草生产的瓶颈,最近几年皖南烟区烟草病毒病的发生也逐年加重,已替代青枯病[来自www.lw5U.com]成为主要病害。而且安徽省两大烟区的病毒种类及病毒种群的变化也一直没有人研究,这给烟草病毒病害的防治工作带来很大困难。因为烟草病毒种类不同,其生物学特性如越冬越夏场所、传染途径等差异很大,相应的的防治措施也有所不同。为减轻烟草病毒病危害,明确当前安徽南北烟区烟草病毒病发生发展的变化趋势,重新鉴定安徽烟草病毒种类已成为当务之急。本研究将采用比较先进的TAS -ELISA为主的检测手段来鉴定安徽烟草的病毒种类,为针对性地制定安徽烟草病毒病的有效防治措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病样 2007年6月从安徽宣城、芜湖和亳州等地的烟草产区共采集181个病样,病样表现为花叶、叶脉坏死、皱缩、泡斑、线叶、矮化等典型病毒病症状,其中宣城黄渡乡25个病样,宣城金坝乡28个,芜湖红杨乡31个,芜湖三元乡27个,毫州陈店乡70个。

共检测病样112个,其中宣城黄渡、宣城金坝、芜湖红杨、芜湖三元分别为16个,毫州陈店48个。

1.1.2 试剂 PVY ELISA检测试剂盒(PotatoVirus Y Compound Direct ELISA).美国Agdia公司;TMV,CMV单克隆抗体和多克隆抗体,浙江大学生物技术研究所惠赠:碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG,Promega公司;硝基苯磷酸酯钠盐,Sig[来自www.Lw5U.com]ma公司;96孔酶标板,美国Coming公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Tas-ELISA测定TMV和CMV 参考谢艳等的方法p1,TMV,CMV多克隆抗体1:5 000倍稀释后包被酶标板,37℃孵育3h;加入病汁液样品,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉液封闭,37℃孵育0.5 h;TMV,CMV单克隆抗体1:5 000倍稀释后,37℃孵育2 h;碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG l:2 500倍稀释后,37℃孵育3 h:硝基苯磷酸酯钠盐显色,37℃显色0.5 h后观察并记录。每步用含吐温的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次(封闭后不洗),测定时每个样品均设2次重复。

1.2.2 间接ELISA检测PVY 病汁液样品包被酶标板,4℃过夜或37℃孵育2h; 5%脱脂奶粉液封闭,37℃孵育0.5 h; PVY单克隆抗体1:200倍稀释后,37℃孵育1h;碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG l:2 500倍稀释后,37℃孵育3 h;加底物显色0.5小时后观察并记录。每步用PBST缓冲液洗涤3次(封闭后不洗),测定时每个样品均设2次重复。

2 结 果

宣城黄渡、宣城金坝、芜湖红杨、芜湖三元各16个病样以及亳州陈店48个病样TMV, CMV, PVY的ELISA检测结果见表1-5。宣城黄渡16个病样中,TMV, CMV, PVY阳性的样本数分别为15,0,4,而TMV, PVY复合侵染样本3个(表1):宣城金坝16个病样中,TMV, CMV, PVY阳性的样本数分别为14,1,12,而TMV, CMV复合侵染样本1个,TMV,PVY复合侵染样本10个(表2);芜湖红杨16个病样中,TMV, CMV, PVY Pg性的样本数分别为9,0,12,而TMV和PVY复合侵染样本5个(表3);芜湖三元16个病样中,TMV, CMV, PVY pB性的样本数分别为12,o,12,而TMV, PVY复合侵染样本8个(表4);毫州陈店48个病样中,TMV, CMV, PVY p6性的样本数分别为48,24,4,而TMV, CMV复合侵染样本22个,TMV, PVY复合侵染样本2个,TMV, CMV, PVY复合侵染样本2个(表5)。

对安徽各烟区烟草病样阳性率进行统计,结果见表6。宣城32个病样中,TMV, CMV, PVY阳性率分别为91%,3%,50%,两种病毒复合侵染率达44%:芜湖32个病样中,TMV, CMV, PVY PB性率分别为66%,0,75%,两种病毒复合侵染率达41%:亳州48个病样中,TMV, CMV, PVY pB性率分别为1 00%,50%,8%,两种病毒复合侵染率达50%,3种病毒复合侵染率为4%。

3 讨 论

笔者从宣城、芜湖为代表的皖南烟区以及亳州为代表的皖北烟区采集烟草病毒病样并进行ELISA检测。结果显示,安徽宣城32个病样中,TMV, CMV, PVY的阳性率分别为91%,3%,50%,芜湖32个病样中,TMV, CMV, PVY的阳性率分别为66%,0,75%,说明宣城、芜湖烟区侵染烟草的病毒种类以TMV, PVY为主,CMV仅为零星侵染;亳州48个病样中,TMV, CMV, PVY的阳性率分别为l00%,50%,8%,说明亳州烟区侵染烟草的病毒种类以TMV和CMV为主,PVY仅为零星侵染。

田间观察发现,宣城、芜湖为代表的皖南烟区,烟株普遍表现为花叶症状,但叶片不表现畸形,植株矮化不明显,这与TMV侵染引起的花叶病症状一致,ELISA检测也证实了这一点,宣城、芜湖烟草病样TMV阳性率达91%和66%,CMV pB性率极低,仅为0~3%,田间未发现CMV侵染引起的典型症状。宣城、芜湖烟草病样的PVY阳性率分别为50%和75%,可见PVY造成的危害和损失在皖南烟区己不容忽视,田间病株表现为叶脉坏死、叶片黄化、病叶较正常叶窄、植株长势弱等症状,局部田块如芜湖三元发现部分田块的PVY病株率达800-/0以上,整个田块呈枯黄一片,烟叶几乎失去烘烤价值。

2001年皖北烟区发生的主要病毒种类为PVY和CMV,其中CMV占42.31%,PVY占61.54%,复合侵染也主要由PVY和CMV引起,复合侵染率为32.69%。2007年在亳州烟区调查发现,田间的花叶病株有近40%表现出CMV侵染引起的典型症状,如线状叶、鼠尾叶、泡斑以及植株明显矮化等畸形症状。ELISA检测证明田间花叶病株有50%是由于TMV和CMV复合侵染引起的,而PVY在皖北亳州烟区危害并不严重,这与6年前皖北烟草病毒种类的发生情况有所变化。

田间调查发现,除了TMV, CMV, PVY这3种主要病毒危害烟草,烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草环斑病毒(TRSV)危害症状也零星发现,其准确发病率有待继续探索。由于仅为一年的研究结果,而田间病毒种类及侵染率可能随蚜虫的发生或植烟品种的改变发生年度间变化,因此,安徽烟草病毒病的变化趋势,还需要继续监测。

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