论文无忧 | 论文发表 | 手机版 | 二维码

《中国烟草科学》杂志
本刊往期
您当前的位置:首页 杂志文章 非硝酸盐还原细菌K18降低TSNA机理的初步研究
非硝酸盐还原细菌K18降低TSNA机理的初步研究_杂志文章
非硝酸盐还原细菌K18降低TSNA机理的初步研究
发布时间:2018-05-09浏览次数:15返回列表

摘 要:对21株烟草内生细菌还原硝酸盐和亚硝酸盐的能力进行检测,验证了非硝酸盐还原细菌K18的内生性,并鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp)。结果表明,用K18菌株对烟草进行移栽前浸根、团棵期喷施、旺长期喷施及采前喷施处理,可有效降低烟叶中TSNA含量,降低程度与烟草品种有关。温室中TSNA的降低作用与烟叶的细菌数量相关,K18处理的云烟87,团棵期和旺长期烟叶细菌数量增高,TSNA分别降低23.7qo和9.1%;云烟87和TN86经K18处理后,NNN降低百分率最高,而且对TN86各组分的降低百分率高于云烟87。对于大田栽培的云烟87,旺长期喷雾和浸根处理可显著降低烟叶中TSNA含量,与清水对照比较,分别使TSNA含量降低了50. 1%和39.6%。对于大田栽培的TN86,旺长期喷雾、调制期喷雾和浸根处理使烟叶中TSNA含量分别降低52.6%,51.1%和44.7%。

TSNA是一类烟草生物碱亚硝化而形成的化合物,主要形成于烟叶调制和储存过程中。通过添加有益于烟叶陈化的内在或外源微生物或其代谢产物降低烟叶TSNA,已成为目前的研究热点之一。祝明亮等和张玉玲等研究表明,还原硝酸盐的内生细菌可显著降低烟叶中TSNA含量;据雷丽萍等报道,芽孢杆菌WT(Bacillus sp)可有效降低白肋烟TN86的TSNA总量,但该菌株并不能还原硝酸盐,因此内生菌对TSNA的降低作用不一定与硝酸盐细菌的还原相关。笔者研究了非硝酸盐还原内生细菌K18处理对烟叶表面微生物数量的影响以及对烟叶中TSNA的降低作用,以期为如何降低TSNA的含量提供思路。

1 材料与方法

1.1 不同硝酸盐还原能力的内生细菌筛选

选取21株细菌接种于硝酸盐液体培养基,室温培养l,3,Sd,检测细菌对硝酸盐和亚硝酸盐的还原能力。每株3个重复,以不接种处理作对照。

1.2 非硝酸盐还原菌株K18的内生性及种属鉴定

1.2.1 K18菌株的內生性验证 配制含1,4,16,32,64,128 mg/L利福平等不同浓度的肉汁胨培养液。将细菌K18从低浓度到高浓度培养,诱导其对利福平的抗性。将耐128 mg/L的K18在常规NA培养基上继代培养,再回接到含利福平128 mg几的培养基中检测其耐药稳定性,从而获得利福平标记菌株。温室移栽烟苗,7d后在烟草茎基部注射接种标记菌株,10-14 d后,用含利福平64 mg几的NA培养基进行内生细菌K18的分离、计数。

1.2.2 K18菌株的鉴定 采用大连宝生物的提取试剂盒,提取K18的基因组DNA,以通用引物进行16 SrDNA的扩增,扩增的反应体系为:lOx扩增缓冲液5uL,4种dNTP混合物各100 umol/L,引物各5 pmol,模板DNA 2uL,DNA聚合酶2.5 uL,Mg2+ 1.5 mmol/L,加双或三蒸水至50 uL; PCR扩增反应条件:94℃变性4min,接下来的30循环为94℃变性40 s,60℃退火40 s,72℃延伸2min,循环结束72℃延伸1O min,用1%琼脂糖电泳对扩增产物进行检测,并用大连宝生物的纯化试剂盒进行扩增产物的纯化,纯化产物送大连宝生物公司进行序列测定。

1.3 K18处理的温室烟叶微生物及TSNA测定

1.3.1 菌悬液制备 将选择好的菌株接种于TSA培养基平板上,30℃暗培养。制备菌悬液,[来自wwW.Lw5u.coM]血球记数板计数,配成浓度≥107 cfu/g的菌悬液。

1.3.2 实验设计及处理 供试品种:云烟87和TN86。采用漂浮育苗法,成苗后温室处理:A)细菌悬浮液浸根24 h后移栽,以无菌水浸根为对照;B)旺长期叶面喷施;C)采收前l周叶面喷施;D)采收时叶面喷雾;E)对照(清水)。各处理均按田间正常的生产管理方式进行管理,分别按常规程序进行采收、烘烤及砍株晾制。

1.3.3 微生物群体数量检测 烟叶调制期,分别选取各处理着生部位一致的烟时2片供室内检测。首先对K18不同方式处理的样品进行定量,将定量样品进行碾磨,用定量无菌水制成烟草组织匀浆液,分别稀释成100,10-l,102三个梯度,进行细菌总数和真菌总数的检测。

1.3.4 TSNA组分测定 按照刘万峰等方法,测定各烟草样品中NNN,NNK和(NAT+ NAB)含量。

1.4 K18处理的大田烟叶TSNA测定

1.4.1 材料 内生细菌菌株K18;供试烟草品种为云烟87和TN86。

1.4.2 方法 同温室试验,但菌悬液处理期分别为浸根处理、旺长期喷雾、采前喷雾和调制期喷雾。

2 结 果

2.1 细菌对硝酸盐和亚硝酸盐的还原能力

菌株K19,K18,K28,K16不具有还原硝酸盐的能力:菌株K25,K17,K33,K22,K30,K26,K24,K31,K21,K29,K34,K23,K32硝酸盐还原反应呈阳性,说明具有还原硝酸盐的能力;菌株K20,K35,K36,K27对硝酸盐的还原能力比较弱。上述21个菌株对亚硝酸盐还原不彻底,反应为阴性(表1)。

2.2 非硝酸盐还原菌株K18的内生性

通过对非硝酸盐还原内生细菌K18的抗生素标记,成功获得耐128 mg/L利福平的抗药性标记菌株。烟苗根茎部接种K18耐药菌株后,未发现烟苗出现病变。14 d后,从烟叶中回收到的K18数量为86±36.5 cfu/g,从茎杆中回收306±69.5 cfu/g。K18可在烟草茎、叶中大量存在,且在茎杆中数量高于叶片,说明它在烟草内部能够生长繁殖和扩展传播,由此确认K18是烟草内生细菌。

2.3 K18菌株的种类鉴定

经过对内生细菌DNA的提取,得到符合进行PCR反应的基因组DNA,浓度为30~60 ng/uL。PCR扩增产物经过琼脂糖电泳,可成功扩增出长度约为1.5 kb的核酸片段。

扩增产物经过琼脂糖电泳后,再进行切胶纯化,得到了纯化的DNA扩增片段,经过紫外检测浓度为35~80 ng/uL。

通过对内生细菌K18的16S rDNA的序列与Genebank数据库的相关序列的比对,可知K18与Stenotrophomonas mal,tophilia (AJ131117.1),Stenotrophomonas sp. CK6 (AJ0967.1)的同源性在100%,将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌属。

2.4 K18对不同生长期烟草微生物群体数量的影响

移栽前采用内生细菌菌剂的浸根处理,在团棵期和旺长期检测烟草接种菌剂对烟草内生真菌和内生细菌数量的影响,结果见表2。内生细菌浸根处理对烟草内生真菌的影响无特定规律,对烟草内生细菌的影响差异较大。云烟87无论在团棵期还是旺长期,K18处理后的细菌含量均高于对照,而真菌与对照持平或略低;TN86经K18处理后,旺长期的细菌和真菌数量与对照差别不大,团棵期细菌数量低于对照,而且旺长期细菌数量远低于团棵期,旺长期真菌数量与对照差别不大,但团棵期真菌数量远高于对照。

2.5 K18对温室烟叶TSNA的降低作用

温室试验表明,K18对云烟87和TN86烟叶TSNA的降低作用不同(表3)。对于云烟87,团棵期喷[来自wWw.lW5u.Com]雾处理使烟叶TSNA总量降低23.7%,使所检测的TSNA的4种组分(NNN,NAT+NAB和NNK)都有所降低,分别降低了35.9%,13.2%和25.9%:旺长期喷雾后,烟叶NNN含量降低6.2%,未检测到NNK。对于白肋烟TN86,K18浸根处理和旺长期喷雾使NNN含量分别降低了24.6%和17.9%,而采前喷雾和浸根处理后的TN86烟叶未检到NNK。

2.6 K18对大田烟叶TSNA的降低作用

大田烟草不同生长时期用K18菌悬液处理,均可降低TSNA的总量(表4),但不同烟草品种的最有效处埋方式不同:云烟87旺长期喷雾和浸根处理,可显著降低烟叶TSNA含量,与清水对照比较,分别降低50.1%和39.6%; TN86旺长期喷雾、调制期喷雾和浸根处理,烟叶TSNA含量分别降低52.6%,51.1%和44.7%。

3 讨 论

烟草TSNA的形成受生物碱和亚硝酸的双重影响,其形成途径有2条烟草生物碱在微生物的作用下发生亚硝化作用生成TSNA;2)硝酸盐在微生物的作用下生成亚硝酸盐,这些亚硝酸盐和其它氮氧化物再与烟草生物碱反应生成TSNA。烟草内生硝酸盐还原细菌可抑制引起TSNA积累的自然微生物类群,从而降低烟叶中TSNA。非硝酸盐还原细菌也可以降低烟叶中的TSNA,笔者分离到的嗜麦芽寡养单胞菌K18为非硝酸还原内生细菌,对不同生长期处理的不同品种烟草,无论在温室抑或大田试验中,都可以有效降低烟叶TSNA总量,在田间的降低作用尤为明显。对温室接种K18后烟叶细菌和真菌总数的检测结果表明,在团棵期和旺长期,云烟87的细菌数量高于对照,真菌数量低于对照,对TSNA的降低作用明显,而TN86的细菌数量低于对照,真菌数量高于对照,对TSNA无降低作用。以上结果说明,接种后内生细菌可在植株内定殖、繁殖并在烟草植株内转移,从而影响烟叶的微生物数量,特别是对烟叶细菌总数有明显的影响,推测K18在烟草植株内的定殖是降低TSNA的重要途径。对K18在烟株中的定位跟踪,以及内生细菌处理对烟草内生微生物和叶面微生物的物种多样性的影响,将为揭示内生细菌降TSNA机理提供新的思路。

研究中还发现,K18主要是降低了TSNA的主要组分NNN。由于烟碱和降烟碱是NNN的主要前体物,而降烟碱含量与NNN呈正相关关系,且相关性大于烟碱与NNN的相关性,因此烟叶中NNN的降低很有可能与烟碱和降烟碱的降低有关。K18菌株是否通过降低烟碱和降烟碱的含量,进而降低烟叶中的TSNA,这还需进一步研究。

您对《非硝酸盐还原细菌K18降低TSNA机理的初步研究》一文的评论