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《中国烟草科学》杂志
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烟草赤星病菌(Alternaria longipes)产角质酶液体发酵条件的优化_杂志文章
烟草赤星病菌(Alternaria longipes)产角质酶液体发酵条件的优化
发布时间:2018-05-09浏览次数:25返回列表

摘 要: 以基础培养基(查彼培养基+碳酸钙+苹果角质)为营养优化了长柄链格孢(A lternarid:r Jo。gipe,)产角质酶的环境和营养条件。结果表明,最佳产酶的环境条件是:培养时间8d,培养温度25℃,pH 5.5;通过正交试验确定最佳产酶的营养条件是:蔗糖3%,干酪素1%,吐温-800.3 %;酶活高达175.2 IL/mL,是基础培养基酶活力的11.0倍。

角质酶是丝氨酸酯酶的一种,可催化水解不溶性角质的酯键,不同真菌来源的角质酶相对分子质量差异较大,但多数在20~25 kDa。大多数的角质酶都来源于植物病原真菌,目前多种植物病原真菌中的角质酶得到研究。

植物病原真菌在侵染过程中遇到的第一道屏障是植物的角质层。病原真菌产生角质酶用来克服角质层的障碍。病原真菌的角质酶在病菌致病过程中有重要作用,产角质酶能力与其致病性存在相关性,在茄腐皮镰孢豌豆专化型(Fusariumsolanisp. Pisi)的研究中发现,致病力强的菌株,产角质酶能力也强。毕凤珍等对Thermobifidafusca产角质酶摇瓶发酵条件进行了研究,之后同一研究室又对此菌的高产角质酶突变株进行了发酵研到,目前国内还没有对植物病原菌产角质酶的报道。烟草赤星病是烟草生产上重要病害之一,烟草赤星病菌(Alternaria longipes)产生的角质酶在侵染过程中的作用,国内外尚未见报道。为了获得更大量的角质酶蛋白质,以期研究烟草赤星病菌在侵染烟草过程中产角质酶的作用和酶学性质,笔者对此菌液体培养的发酵条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 菌株和试剂

烟草赤星病菌(Alternaria longipes)强致病力菌株TBA28, 于P[来自www.lW5u.CoM]DA斜面上4℃保存。PNB(p-nitrophenyl butyrate)购自Sigma公司,其它试剂均为国产分析纯。

液体发酵基础培养基配方:蔗糖30 g/L,NaN032 g/L,MgS047H20 0.5 g/L,KCI0.5 g/L,K2HP04 lg/L,FeS04-7H20 0.01 g/L,CaC031 g/L,0.2%苹果角质。

1.2 苹果角质的制备

将苹果皮在草酸缓冲液(草酸4 g/L、草酸铵16g/L)中煮沸th,蒸馏水彻底冲洗后用氯仿一甲醇(V:V>2:1)过夜提取,再用氯仿抽提24h,105℃烘干,液氮中研磨、备用。

1.3 环境和营养条件对产角质酶活力的影响

将直径1 cm菌圆片接入100 mL液体培养基中,按下面不同目的进行相应实验。培养滤液真空抽滤后,4℃条件下10 000 r/min离心10 min,上清液用于酶活测定。实验至少3次重复。

1.3.1 培养时间及苹果角质对酶活性的影响 以基础培养基为营养,25℃条件下培养,分别在2,4,6,8,10,12,14d取样,同时以不加苹果角质为对照,进行发酵培养。

1.3.2 温度 以基础培养基为营养,分别于15,20,25,28,37℃等5个温度梯度下培养。

[来自WWw.lw5u.com] 1.3.3 pH 将基础培养基的初始pH调至4.0,4.8,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5等7个梯度。

1.3.4 碳源 以基础培养基为营养,将蔗糖分别替换为蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、淀粉,浓度均为3%。

1.3.5 氮源 以基础培养基为营养,将硝酸钠分别替换为干酪素、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、尿素、硝酸钠、氯化铵,前三者浓度均为2%,后四者浓度均为0.3%。

1.3.6 正交试验 对选定的最佳碳、氮源和表面活性剂吐温-80等进行3因素3水平正交试验。

1.4 酶活力测定

以PNB为底物测定酶的活力。反应体系为1.8 mL,包括200 uL的粗酶液、200 uL 0.4%的Tritonx-100、1 380 uL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)和20 uL l.76%的PNB溶液。于37℃反应10nun后,405 nm处测定吸光值。酶活定义:在反应条件下,将每毫升酶液每分钟产生对硝基酚的微克数定义为1个酶活力单位。

2 结 果

2.1 培养时间对角质酶活力的影响

为了确定最佳产酶时间,在基础培养基的营养条件和25℃下摇瓶培养A.longipes。从图1看出,随培养时间的延长,酶活力逐渐升高,至第8d达到产酶高峰,之后逐渐降低,因此最佳产酶时间在第8d。图l还表明,A.longipes产生的角质酶是一种诱导酶,该病原菌经角质诱导,第8d角质酶的产量比对照提高了近5.7倍,证明角质对角质酶的产生具有明显的促进作用。

2.2 培养温度对角质酶活力的影响

在基础培养基的营养条件下,确定最佳培养温度条件(图2)。图2表明,在25℃以下,随温度升高酶活也逐渐增高;在20~25℃范围内,酶活有所升高但幅度不大:25℃以上,随温度升高酶活逐渐降低。因此,确定最佳产酶温度为25℃。

2.3 初始pH对角质酶活力的影响

图3确定了产角质酶的最佳初始pH。该图表明,在pH 4.0~5.5范围内,随着pH升高,酶活力也逐渐升高,pH 5.5是最佳产酶酸碱度;pH 5.5以上,随pH的升高酶活力降低。

2.4 碳源和氮源对角质酶活力的影响

在选择的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和淀粉等6种碳源中,图4(A)说明麦芽糖和蔗糖产酶活力较高,葡萄糖和淀粉产酶活力较低,考虑到蔗糖比麦芽糖更廉价,以蔗糖作为产酶糖源:氮源方面选择了4种有机氮源和3种无机氮源,从图4(B)总体来看,有机氮源优于无机氮源,而在有机氮源中,干酪素是最好的氮源。因此以干酪素为产酶氮源。

2.5 最佳碳和氮源配方对角质酶活力的影响

为进一步优化产酶培养基配方,在单因素实验基础上,进行正交试验,以确定最佳组合。吐温-80作为一种非离子表面活性剂,能促进一些胞外酶的产生,故将其作为正交设计的1个考察因素。笔者对蔗糖、干酪素和吐温-80等进行3因素3水平试验,采用L9(34)正交表。从表1看出,碳源、氮源及表面活性剂3个因素中,因素B(干酪素)极差变化最大,其对产角质酶的影响最大;因素A(蔗糖)对产酶影响最小。因此,确定A3B1C3为最佳组合。与基础培养基相比,优化后的培养基产角质酶活性由原来的15.8 U/mL提高至175.2 U/mL,提高了11.0倍。

3 讨 论

不同真菌的生物学特性不同,产酶需要的环境和营养条件也有差异。本研究表明,苹果角质对烟草赤星病菌(Alternaria longipes)产角质酶具有诱导作用,这与Li和Davies等对其它病原真菌产角质酶的报道一致。A.longipes经角质诱导后,酶活提高了近5.7倍,发酵培荞中第8d达到产酶高峰。碳源作为发酵培养基的主要组成部分,主要作用是为微生物生长和代谢提供能源。前人研究表明,微生物产角质酶受葡萄糖抑制,本研究也表明,A.longipes除葡萄糖外,淀粉和乳糖都对角质酶的产生有抑制作用,而麦芽糖和蔗糖对角质酶的产生有促进作用。温度对发酵的影响至关重要,它主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。在A.alternata的发酵过程中,温度较低时菌丝稀少,产酶量少;20℃后生长代谢加快,产酶量显著提高;25℃产酶量最大,以后随着温度升高,菌丝逐渐衰老,产酶量逐渐下降。

发酵液的初始pH对产酶也是一个重要的影响因素。随着初始pH升高,菌体生长加快,代谢增强,酶活逐渐升高,pH 5.5时达到最高。以后随着pH的升高,发酵过程中菌体生长明显减慢,酶活也大幅下降。

角质酶的分泌与细胞膜的通透性密切相关。非离子表面活性剂吐温-80能促进一些细胞胞外酶的产生,本研究在发酵过程中添加吐温-80角质酶酶活性明显提高。

角质酶除了在植物一病原物互作方面得到研究外,在食品、化工和纺织等诸多领域皆有广泛应用,因此,角质酶的研究具有广泛的理论与实践意义。目前,笔者正对此角质酶进行纯化,并研究其在烟草赤星病菌侵染过程中的作用。

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